產(chǎn)品名稱：大鼠（Rat）活性氧簇（ROS）ELISA 檢測(cè)試劑盒

貨號(hào)：YS-S588

規(guī)格：48T／96T

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檢測(cè)原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往
預(yù)先包被活性氧簇（ROS）抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)
品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，
TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終
的黃色。顏色的深淺和樣品中的活性氧簇（ROS）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)
儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品含量。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)
胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心
地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心 30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘
取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存
于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1. 酶標(biāo)儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
操作注意事項(xiàng)
1. 試劑盒保存在 2-8℃，使用前室溫平衡 20 分鐘。從冰箱取出的
濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶完全溶解
后再使用。
2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保
存。
3. 濃度為 0 的 S0 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對(duì)照或者空白；按照說(shuō)明
書(shū)操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋 5 倍，最終結(jié)果乘以 5 才是樣本實(shí)際濃度。
4. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5. 所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑的準(zhǔn)備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按 1：20 稀釋，即 1 份的 20×洗滌
緩沖液加 19 份的蒸餾水。
洗板方法
1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置 1min 后甩盡
孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板 5 次。
2. 自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液 350μL，浸泡 1min，洗板 5 次。
操作步驟
1. 從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自
封袋密封放回 4℃。
2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50μ
L；
3. 樣本孔先加待測(cè)樣本 10μL，再加樣本稀釋液 40μL；空白孔不
加。
4. 除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶
（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體 100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋
或恒溫箱溫育 60min。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置 1min，甩去
洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板 5 次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6. 每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。
7. 每孔加入終止液 50μL，15min 內(nèi)，在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的
OD 值。
大鼠（Rat）活性氧簇（ROS）ELISA 檢測(cè)試劑盒結(jié)果判斷
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在 Excel 工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)
OD 值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣
本濃度值。