布魯氏菌（brucellosis）為病原微生物，是一種細胞內(nèi)寄生小球桿狀菌，
革蘭氏染色陰性，主要感染牛、羊、豬、狗以及駱駝、鹿等動物。布魯氏菌主要
是通過接觸感染的動物或者吃被感染的食物以及實驗室接觸等方式傳播給人類，
能引起人和多種動物的急性和慢急性疾病，被感染的人和動物表現(xiàn)為流產(chǎn)及不孕
不育等癥狀。
本試劑盒采用聚合酶鏈式反應（PCR）結(jié)合 Taqman 技術，對布魯氏菌的
特異性 DNA 核酸片段進行熒光檢測，可用于臨床對布魯氏菌的輔助診斷，使用
方便，即開即用。血液、骨髓、關節(jié)腔液及病畜的組織、奶、奶制品均可作為本
試劑盒的檢測標本。標本可立即用于檢測，也可保存在-20℃待測。標本運送應
在低溫條件下進行。

運輸及保存:

使用方法:

一、標本、對照品的核酸裂解處理
1. 骨髓、關節(jié)腔液、血清等液態(tài)標本：取 50 μL 樣本，加入 50 μL 核酸提取
液充分混勻，沸水浴 10 分鐘，然后 13,000 rpm 離心 10 分鐘，取上清 4
μL 作為 PCR 反應模板。
2. 全血 PBMC 分離：取抗凝血 1 mL，與 Hank’s 液（PBS 或生理鹽水）1：
1 混勻后，小心加于 2 mL 的細胞分離液的液面上，2000 rpm 離心 15 分
鐘（半徑 15 cm 水平轉(zhuǎn)子），收集界面上的細胞（中間呈白色層），置于 1.5
mL eppendorf 管中，2000 rpm 離心 10 分鐘，棄上清液。沉淀中加入
50 μL 核酸提取液，振蕩 10 秒，99℃干浴或水浴 10 分鐘，13,000 rpm
離心 10 分鐘，保留上清備用。
3. 奶標本：取奶 3 mL ，13,000 rpm 離心 2 分鐘；棄去上清，沉淀中直接
加入 100 μL DNA 提取液充分混勻，沸水浴 10 分鐘（誤差不超過 1 分鐘）。
13,000 rpm 離心 5 分鐘，取上清 4 μL 做 PCR 反應。
4. 超純水作為陰性對照。如進行定量檢測，陽性對照品（1×107
copies/mL）需
要進行 10、100、1000 倍梯度稀釋。
二、試劑配制
取 n×35 μL 熒光 PCR Mix 與 n×1 μL 內(nèi)部對照品，以及 n×0.4 μL 酶
（Taq+UNG）（n 為反應管數(shù)），振蕩混勻數(shù)秒，3000 rpm 離心數(shù)秒。（備注：
如不使用內(nèi)部對照品，可用 n×1 μL 的超純水代替補足。）
三、加樣
取上述混合液 36 μL 置于薄壁 PCR 反應管或 PCR 反應板中，然后將已處
理標本、陽性對照品、超純水各 4 μL 分別加入薄壁 PCR 反應管或 PCR 反應板
中，蓋好薄壁 PCR 反應管蓋或 PCR 反應板膜，立即進行 PCR 擴增反應。
四、PCR 擴增
反應管置于定量熒光 PCR 儀上，推薦循環(huán)參數(shù)設置如下：
過程 溫度 時間
37℃ 2 分鐘
預變性 94℃ 2 分鐘
PCR 反應
（40 個循環(huán)）
93℃ 15 s
60℃ 60 s
 單點熒光檢測在 60℃。反應體系 40μL。
熒光通道檢測選擇：選用 FAM 和 HEX （或 VIC/JOE）通道。
備注：如使用 ABI 系列 PCR 儀，請務必于 passive reference 和 quencher
處均選擇“none”。
五、基線和閾值設定
基線調(diào)整取 6-15 個循環(huán)的熒光信號，閾值設定原則以閾值線剛好超過超純
水檢測熒光曲線的最高點。
n×35 μL 混合液 + n×1 μL 內(nèi)對照+ n×0.4 μL 酶
n×36 μL分裝 加 4 μL 模板
上機
+
六、校準程序
進行定量檢測時需要進行校準程序，陽性對照品處理和加樣在使用方法的一
和二中已經(jīng)說明；實驗結(jié)束后將陽性對照品濃度輸入儀器軟件中，儀器自動生成
標準曲線。
七、實際結(jié)果的判斷
通道 Ct 值 結(jié)果判斷
FAM UNDET 或 40 樣本低于檢測限，報告為陰性
FAM ≤38 報告為陽性
FAM 38~40 復檢一次，如仍為 38~40，則報告為陰性
進行定量檢測時，儀器生成標準曲線后，自動顯示待測樣品定量值。